Karakterisering av human Endonuklease V

Collection

  • TKD - Student theses

Document type

Publication date

  • 2019-05-22

Publisher

  • OsloMet – storbyuniversitetet

Page Number

  • 79

Abstract

  • Human Endonuklease V (hEndoV) er et enzym som kutter spesifikt i den andre fosfodiesterbindingen 3´ til inosin på RNA. Inosiner er en sentral komponent i tRNA, og hEndoV er derfor i stand til å kutte her. Proteinet RNase L er en endoribonuklease som nylig har blitt vist til å være en ny og potent kilde til kuttet tRNA som aktiveres ved antiviral immunrespons. Hovedmålet med denne oppgaven var å videre kartlegge den biologiske funksjonen til human Endonuklease V. I dette studiet undersøker vi blant annet om aminosyren Y91 i hEndoV er involvert i binding og muligens kutting av RNA-substrater, og om hEndoV villtypen (hEndoV VT) er i stand til å beskytte RNA-substrater fra degradering. I tillegg undersøkes det hvor i cellen immunopresipitert endogent hEndoV fra HAP1-celler er tilstede, og om endogent hEndoV kan kutte i samme RNA-substrat som rekombinant hEndoV. Analyser i denne oppgaven viste at mutanten bandt seg dårligere til alle RNA-substrater testet. Et alternativt kutteprodukt for human Endonuklease VY91A oppsto, og videre analyser kunne tyde på at kutteproduktet kom av generell degradering eller kontaminering av en nuklease tilstede i proteinløsningen. Aktivitetsforsøk viste i tillegg at hEndoV VT har en inhiberende effekt på MBP-His RNase L under betingelsene testet, men forsøket må optimaliseres og reproduseres før en konklusjon kan trekkes. Endogent hEndoV ble vist at kan kutte i ssIIUI-substratet på samme måte som rekombinant hEndoV. Videre analyser viste at det er hEndoV immunopresipitert fra cytoplasmiske fraksjoner som gir oppgav til kutteproduktet under betingelsene testet.